Aplink mus yra daug neapdainuotų didvyrių, kurie atrodo paprasti, bet iš tikrųjų tyliai daug prisideda prie mūsų. Proteinazė K yra „neapdainuotas didvyris“ molekulinės diagnostikos pramonėje, nors, palyginti su „dideliais ir galingais“ pramonės atstovais, proteinazė K yra tokia neįtaigi, kad mes jau seniai pamiršome jos svarbą. Prasidėjus naujajai koronaviruso epidemijai, proteinazės K paklausa smarkiai išaugo, o pasiūla šalyje ir užsienyje gerokai atsilieka nuo vartojimo, ir visi staiga suprato, kokia svarbi yra proteinazė K.
Kam naudojama proteinazė K?
Proteinazė K yra serino proteazė, pasižyminti proteolitiniu fermentiniu aktyvumu ir galinti išlaikyti aktyvumą įvairiose aplinkose (pH (4–12,5), didelio druskos kiekio buferyje, aukštoje 70 °C temperatūroje ir kt.). Be to, proteinazės K aktyvumo neslopina SDS, karbamidas, EDTA, guanidino hidrochloridas, guanidino izotiocianatas ir kt., o tam tikras ploviklio kiekis taip pat gali sustiprinti proteinazės K aktyvumą. Medicininiame gydyme (virusų ir mikrobų dezinfekavimas), maisto gamyboje (mėsos minkštinimas), odos gamyboje (plaukų minkštinimas), vyno gamyboje (alkoholio skaidrinimas), aminorūgščių gamyboje (suderinamos plunksnos), nukleorūgščių ekstrakcijoje, in situ hibridizacijoje ir kt. Proteinazė K yra pritaikoma įvairiais būdais. Dažniausiai naudojama taikymo sritis yra nukleorūgščių ekstrakcija.
Proteinazė K gali fermentuoti visų rūšių mėginio baltymus, įskaitant tuos histonus, kurie yra tvirtai susijungę su nukleorūgštimis, kad nukleorūgštys galėtų būti išskirtos iš mėginio ir išleistos į ekstraktą, palengvinant kitą ekstrakcijos ir gryninimo etapą. Aptinkant virusines nukleorūgštis, proteinazė K yra vienas iš svarbių viruso mėginių ėmimo tirpalo komponentų. Proteinazė K gali suskaidyti ir inaktyvuoti viruso apvalkalo baltymą, todėl jis yra saugesnis transportavimo ir aptikimo etape; be to, proteinazė K taip pat gali skaidyti RNazę, kuri apsaugo nuo virusinės RNR skaidymo ir palengvina nukleorūgščių aptikimą.
Proteinazės K šlovė per naktį
Nesvarbu, ar tai būtų mokslinių tyrimų, ar IVD sritis, nukleorūgščių išskyrimas yra pats paprasčiausias eksperimentas, todėl proteinazė K visada buvo labai svarbi. Tačiau anksčiau proteinazė K buvo daug mažiau žinoma, nei buvo jos vaidmuo. Didelę įtaką tam turėjo labai stabilus proteinazės K pasiūlos ir paklausos santykis. Nedaugelis žmonių pagalvotų, kad proteinazės K pasiūla gali būti problema.
Prasidėjus naujajai koronaviruso epidemijai, smarkiai išaugo nukleorūgščių tyrimų poreikis. Iki 2020 m. birželio pabaigos Kinija atliko beveik 90 milijonų naujų koronaviruso tyrimų, ir šis skaičius pasauliniu mastu kelia dar didesnį nerimą. Nukleorūgščių ekstrakcijos eksperimentuose darbinė proteinazės K koncentracija yra apie 50–200 μg/ml. Paprastai nukleorūgščių mėginiui išgauti reikia apie 100 μg proteinazės K. Praktiškai, siekiant padidinti nukleorūgščių ekstrakcijos efektyvumą, dažnai naudojamas didesnis proteinazės K kiekis. Nukleorūgščių aptikimas naujajame koronaviruse sukėlė didelę proteinazės K paklausą. Pradinė proteinazės K pasiūlos ir paklausos pusiausvyra greitai buvo sutrikdyta, ir proteinazė K per naktį tapo svarbia epidemijos prevencijos medžiaga.
Proteinazės K gamybos sunkumai
Nors epidemijos metu žmonės įvertino svarbią proteinazės K vertę, gėda, kad dėl pernelyg menkos proteinazės K koncentracijos nedaug vietinių įmonių užsiima proteinazės K gamyba. Kai žmonės nori pradėti proteinazės K gamybą, gamybos proceso metu buvo nustatyta, kad proteinazė K yra itin ypatingas baltymas. Per trumpą laiką itin sudėtinga padidinti proteinazės K gamybos pajėgumus.
Didelio masto proteinazės K gamyba susiduria su šiais sunkumais
1. Žema išraiška
Proteinazė K gali nespecifiškai skaidyti daugumą baltymų ir sukelti didelį toksiškumą ekspresijos šeimininko ląstelei. Todėl proteinazės K ekspresijos lygis paprastai yra labai žemas. Ekspresijos sistemų ir padermių, kurios labai ekspresuoja proteazę K, atranka paprastai reikalauja ilgesnio ciklo.
2. Pigmentų ir nukleorūgščių liekanos
Didelio masto fermentacijos metu susidaro didelis kiekis pigmento ir šeimininko nukleorūgščių liekanų. Šias priemaišas sunku pašalinti paprastu gryninimo procesu, o sudėtingas valymas padidina sąnaudas ir sumažina išgavimo greitį.
3. Nestabilumas
Proteinazė K nėra pakankamai stabili, ji gali pati save fermentuoti, ir ją sunku stabiliai laikyti 37 °C temperatūroje ilgą laiką be apsauginės medžiagos.
4. Lengva nusodinti
Ruošiant liofilizuotus proteinazės K miltelius, siekiant užtikrinti, kad juose būtų didelis kietosios proteinazės K kiekis, būtina pridėti didelės koncentracijos liofilizuotą apsauginį agentą, tačiau kai proteinazės K koncentracija pasiekia 20 mg/ml ir daugiau, tai lengva padaryti. Agregacija sudaro nuosėdas, kurios labai apsunkina liofilizuotą proteinazės K su dideliu kietosios medžiagos kiekiu liofilizavimą.
5. Didelės investicijos
Proteinazė K pasižymi stipriu proteazės aktyvumu ir gali hidrolizuoti kitas proteazes laboratorijoje. Todėl proteinazei K reikalingos specializuotos gamybos patalpos, įranga ir personalas tyrimams, plėtrai ir gamybai.
XD BIOCHEM proteinazės K tirpalas
„XD BIOCHEM“ turi brandžią baltymų ekspresijos ir gryninimo platformą bei didelę patirtį rekombinantinių baltymų ekspresijos ir gryninimo bei gamybos procesų optimizavimo srityse. Greitai suformavus tyrimų ir plėtros komandą, buvo įveiktas didelio masto proteinazės K gamybos procesas. Mėnesinis liofilizuotų miltelių kiekis viršija 30 kg. Produktas pasižymi stabiliu veikimu, dideliu fermentų specifiniu aktyvumu ir neturi šeimininko citochromo bei nukleorūgščių likučių. Susisiekite su „XD BIOCHEM“ ir gaukite bandomąjį paketą (el. paštas:sales@xdbiochem.comTel.: +86 513 81163739).
„XD BIOCHEM“ techniniai sprendimai apima
Naudojant daugiakopijinę plazmidžių integraciją, atrenkamos aukštos raiškos padermės, kurių raiškos lygis yra 8 g/l, taip išsprendžiant žemo proteinazės K raiškos lygio problemą.
Įdiegus daugiapakopį gryninimo procesą, proteinazės K šeimininko citochromo ir nukleorūgščių liekanos buvo sėkmingai pašalintos žemiau standartinės vertės.
Atlikus didelio našumo apsauginių buferinių formulių atranką, buvo pasirinktas buferis, kuris gali stabiliai laikyti proteinazę K 37 °C temperatūroje.
Atrankos buferiai išsprendžia problemą, kad proteinazė K lengvai agreguojasi ir nusodinama esant didelėms koncentracijoms, ir sudaro sąlygas didelio kietosios medžiagos kiekio proteinazės K šaldymo džiovinimui.
XD BIOCHEM proteinazės K mėginys
XD BIOCHEM proteinazės K stabilumo testas: po 80 dienų kambario temperatūroje reikšmingų aktyvumo pokyčių nebus.
XD BIOCHEM proteinazės K stabilumo testas: po 80 dienų kambario temperatūroje reikšmingų aktyvumo pokyčių nebus.
XD BIOCHEM proteinazės K ir konkuruojančių produktų nukleorūgščių ekstrakcijos efekto palyginimas. Nukleorūgščių ekstrakcijos procese atitinkamai naudojama XD BIOCHEM ir konkurencinė proteinazė K. XD BIOCHEM proteinazės K ekstrakcijos efektyvumas yra didesnis, o tikslinio geno Ct vertė – mažesnė.
Įrašo laikas: 2021 m. gruodžio 31 d.