Aplink mus daug neapdainuotų herojų, kurie lyg ir paprasti, bet iš tiesų tyliai prie mūsų daug prisideda.Proteinazė K yra „neišgirstas herojus“ molekulinės diagnostikos pramonėje, nors, palyginti su „didžiąja ir galinga“ pramonėje, proteinazė K yra tokia menka, kad mes seniai pamiršome jos svarbą.Prasidėjus naujajai karūnos epidemijai, proteinazės K paklausa labai išaugo, o pasiūla šalyje ir užsienyje gerokai atsilieka nuo vartojimo, ir visi staiga suprato, kad proteinazė K yra tokia svarbi.
Kam naudojama proteinazė K?
Proteinazė K yra serino proteazė, turinti proteolitinio fermento aktyvumą ir gali palaikyti aktyvumą įvairiose aplinkose (pH (4-12,5), didelio druskos kiekio buferyje, aukštoje 70°C temperatūroje ir kt.).Be to, proteinazės K aktyvumo neslopina SDS, karbamidas, EDTA, guanidino hidrochloridas, guanidino izotiocianatas ir kt., o tam tikras ploviklio kiekis taip pat gali sustiprinti proteinazės K aktyvumą. Gydant (virusų ir mikrobų dezinfekcijai) ), maistas (mėsos minkštinimas), oda (plaukų minkštinimas), vyno gamyba (alkoholio skaidymas), aminorūgščių paruošimas (suskaidytos plunksnos), nukleorūgščių ekstrahavimas, hibridizacija in situ ir kt., proteinazė K Yra pritaikymų.Dažniausiai naudojamas nukleino rūgšties ekstrahavimas.
Proteinazė K gali fermentuoti visų rūšių baltymus mėginyje, įskaitant tuos histonus, kurie yra glaudžiai susieti su nukleino rūgštimis, kad nukleino rūgštys galėtų išsiskirti iš mėginio ir išleisti į ekstraktą, palengvinant kitą ekstrahavimo ir gryninimo etapą.Nustatant viruso nukleino rūgštį, proteinazė K yra vienas iš svarbių viruso mėginių ėmimo tirpalo komponentų.Proteinazė K gali nulaužti ir inaktyvuoti viruso apvalkalo baltymą, kuris yra saugesnis transportavimo ir aptikimo stadijoje;be to, proteinazė K taip pat gali skaidyti RNazė apsaugo nuo virusinės RNR irimo ir palengvina nukleorūgščių aptikimą.
Proteinazės K šlovė per naktį
Nesvarbu, ar tai būtų moksliniai tyrimai, ar IVD, nukleorūgščių ekstrahavimas yra pats pagrindinis eksperimentas, todėl proteinazė K visada buvo labai svarbi.Tačiau anksčiau proteinazė K buvo daug mažiau žinoma nei jos vaidmuo.Didelė dalis to buvo dėl to, kad proteinazės K pasiūlos ir paklausos santykis buvo labai stabilus.Nedaug žmonių pagalvotų, kad proteinazės K tiekimas būtų problema.
Prasidėjus naujajai karūnos epidemijai, išaugo nukleorūgščių tyrimų paklausa.2020 m. birželio pabaigoje Kinija atliko beveik 90 milijonų naujų karūnos bandymų, o šis skaičius pasauliniu mastu kelia dar didesnį nerimą.Nukleino rūgščių ekstrahavimo eksperimentuose proteinazės K darbinė koncentracija yra apie 50-200 μg/mL.Paprastai norint išgauti nukleino rūgšties mėginį, reikia apie 100 μg proteinazės K.Faktiškai naudojant, siekiant padidinti nukleorūgščių ekstrahavimo efektyvumą, proteinazė K dažnai bus naudojama padidintu kiekiu.Naujojo koronaviruso nukleino rūgščių aptikimas sukėlė didelį proteinazės K poreikį.Pradinis proteinazės K pasiūlos ir paklausos balansas buvo greitai pažeistas, o proteinazė K per naktį tapo svarbia epidemijos prevencijos medžiaga.
Sunkumai gaminant proteinazę K
Nors epidemijai plintant, žmonės pradėjo vertinti svarbią proteinazės K vertę, gėdinga tai, kad dėl pernelyg mažo proteinazės K kiekio nedaug šalies įmonių dalyvavo proteinazės K gamyboje. Kai žmonės nori nustatyti proteinazės K gamybą Gamybos proceso metu buvo išsiaiškinta, kad proteinazė K yra itin ypatingas baltymas.Labai sudėtinga per trumpą laiką išplėsti proteinazės K gamybos pajėgumus.
Didelio masto proteinazės K gamyba susiduria su šiais sunkumais
1. Žema išraiška
Proteinazė K gali nespecifiškai skaidyti daugumą baltymų ir sukelti rimtą toksiškumą ekspresijos ląstelei-šeimininkei.Todėl proteinazės K ekspresijos lygis paprastai yra labai žemas.Ekspresijos sistemų ir padermių, kurios labai ekspresuoja proteinazę K, atranka paprastai reikalauja ilgesnio ciklo.
2. Pigmentų ir nukleorūgščių likučiai
Didelio masto fermentacijos metu įvedamas didelis kiekis pigmento ir šeimininko nukleorūgščių liekanų.Sunku pašalinti šias priemaišas naudojant paprastą valymo procesą, o sudėtingas valymas padidina išlaidas ir sumažina regeneravimo greitį.
3. Nestabilumas
Proteinazė K nėra pakankamai stabili, gali pati fermentuotis, be apsauginės medžiagos sunku ją ilgai stabiliai laikyti 37°C temperatūroje.
4. Lengva nusodinti
Ruošiant liofilizuotus proteinazės K miltelius, siekiant užtikrinti, kad liofilizuotuose milteliuose būtų didelis proteinazės K kietųjų medžiagų kiekis, būtina pridėti didelės koncentracijos liofilizuotos apsauginės medžiagos, bet kai proteinazės K koncentracija pasiekia 20mg/mL ir daugiau, nesunku. Agregacija sudaro nuosėdas, kurios labai apsunkina proteinazės K, turinčios didelį kietųjų medžiagų kiekį, džiovinimą šalčiu.
5. Didelės investicijos
Proteinazė K turi stiprų proteazės aktyvumą ir laboratorijoje gali hidrolizuoti kitas proteazes.Todėl proteinazei K reikia specializuotų gamybos sričių, įrangos ir personalo tyrimams, plėtrai ir gamybai.
XD BIOCHEM proteinazės K tirpalas
XD BIOCHEM turi brandžią baltymų ekspresijos ir gryninimo platformą, turi didelę rekombinantinių baltymų ekspresijos ir gryninimo bei gamybos procesų optimizavimo patirtį.Greitai suformavus mokslinių tyrimų ir plėtros komandą, buvo įveiktas didelio masto proteinazės K gamybos procesas.Mėnesio liofilizuotų miltelių produkcija yra daugiau nei 30 kg.Produktas pasižymi stabiliu veikimu, dideliu specifiniu fermentu aktyvumu ir neturi šeimininko citochromo bei nukleorūgščių liekanų.Sveiki atvykę į XD BIOCHEM Gaukite bandomąjį paketą (el.sales@xdbiochem.comTel.: +86 513 81163739).
XD BIOCHEM techniniai sprendimai apima
Naudojant kelių kopijų plazmidės integraciją, atrenkamos didelės ekspresijos padermės, kurių ekspresijos lygis yra 8g/L, o tai įveikia žemo proteinazės K ekspresijos lygio problemą.
Sukūrus daugiapakopį gryninimo procesą, proteinazės K šeimininko citochromo ir nukleorūgščių liekanos buvo sėkmingai pašalintos žemiau standartinės vertės.
Atliekant didelio našumo apsauginių buferinių preparatų atranką, buvo pasirinktas buferis, galintis stabiliai laikyti proteinazę K 37 °C temperatūroje.
Atrankos buferiai įveikia problemą, kad proteinazę K lengva agreguoti ir nusodinti esant didelėms koncentracijoms, ir sudaro pagrindą proteinazės K didelio kietųjų medžiagų kiekio džiovinimui šalčiu.
XD BIOCHEM proteinazės K mėginys
XD BIOCHEM proteinazės K stabilumo testas: po 80 dienų kambario temperatūroje reikšmingų aktyvumo pokyčių nebus
XD BIOCHEM proteinazės K stabilumo testas: po 80 dienų kambario temperatūroje reikšmingų aktyvumo pokyčių nebus.
XD BIOCHEM proteinazės K ir konkuruojančių produktų nukleorūgščių ekstrahavimo poveikio palyginimas.Nukleino rūgščių ekstrahavimo procese atitinkamai naudojama XD BIOCHEM ir konkurencinga proteinazė K.XD BIOCHEM proteinazės K ekstrahavimo efektyvumas yra didesnis, o tikslinio geno Ct reikšmė mažesnė.
Paskelbimo laikas: 2021-12-31