IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozidas) yra β-galaktozidazės substrato analogas, pasižymintis dideliu indukuojamumu. Indukuojant IPTG, induktorius gali sudaryti kompleksą su represoriaus baltymu, taip pakeisdamas represoriaus baltymo konformaciją ir neleisdamas jam susijungti su tiksliniu genu, o tikslinis genas bus ekspresuojamas efektyviai. Taigi, kaip eksperimento metu reikėtų nustatyti IPTG koncentraciją? Kuo didesnė, tuo geriau?
Pirmiausia supraskime IPTG indukcijos principą: E. coli laktozės operonas (elementas) turi tris struktūrinius genus, Z, Y ir A, kurie koduoja atitinkamai β-galaktozidazę, permeazę ir acetiltransferazę. lacZ hidrolizuoja laktozę į gliukozę ir galaktozę arba į alo-laktozę; lacY leidžia aplinkoje esančiai laktozei prasiskverbti pro ląstelės membraną ir patekti į ląstelę; lacA perkelia acetilo grupę iš acetil-CoA į β-galaktozidą, o tai reiškia toksinio poveikio pašalinimą. Be to, yra operacinė seka O, pradinė seka P ir reguliacinis genas I. I geno kodas yra represorinis baltymas, kuris gali prisijungti prie operatoriaus sekos O pozicijos, kad operonas (meta) būtų represuotas ir išjungtas. Taip pat yra katabolinio geno aktyvatoriaus baltymo-CAP prisijungimo vieta prieš inicijuojančią seką P. P seka, O seka ir CAP prisijungimo vieta kartu sudaro lac operono reguliavimo sritį. Trijų fermentų koduojančius genus reguliuoja tas pats reguliavimo regionas, kad būtų pasiekta koordinuota genų produktų ekspresija.
Nesant laktozės, lac operonas (meta) yra represijos būsenoje. Šiuo metu I sekos ekspresuojamas lac represorius, kontroliuojamas PI promotoriaus sekos, jungiasi prie O sekos, o tai neleidžia RNR polimerazei prisijungti prie P sekos ir slopina transkripcijos inicijavimą; kai yra laktozės, gali būti indukuojamas lac operonas (meta). Šioje operono (meta) sistemoje tikrasis induktorius nėra pati laktozė. Laktozė patenka į ląstelę ir β-galaktozidazė katalizuoja jos pavertimą alolaktoze. Pastaroji, kaip induktoriaus molekulė, jungiasi prie represoriaus baltymo ir pakeičia baltymo konformaciją, o tai veda prie represoriaus baltymo disociacijos nuo O sekos ir transkripcijos. Izopropiltiogalaktozidas (IPTG) turi tokį patį poveikį kaip ir alolaktozė. Tai labai galingas induktorius, kurio nemetabolizuoja bakterijos ir kuris yra labai stabilus, todėl plačiai naudojamas laboratorijose.
Kaip nustatyti optimalią IPTG koncentraciją? Paimkime, pavyzdžiui, E. coli.
Genetiškai modifikuota E. coli BL21 padermė, turinti teigiamą rekombinantinį pGEX (CGRP/msCT), buvo inokuliuota į LB skystąją terpę, kurioje yra 50 μg·mL-1 Amp, ir kultivuojama per naktį 37 °C temperatūroje. Aukščiau nurodyta kultūra buvo inokuliuota į 10 buteliukų su 50 ml šviežios LB skystosios terpės, kurioje yra 50 μg·mL-1 Amp, santykiu 1:100, ekspansijos kultūrai, o kai OD600 vertė buvo 0,6–0,8, buvo pridėta IPTG iki galutinės koncentracijos. Ji yra 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Po indukcijos toje pačioje temperatūroje ir tuo pačiu metu iš jo buvo paimtas 1 ml bakterijų tirpalo, o bakterijų ląstelės buvo surinktos centrifuguojant ir atliktos SDS-PAGE, siekiant išanalizuoti skirtingų IPTG koncentracijų įtaką baltymų ekspresijai, o tada pasirinkti IPTG koncentraciją, kurioje baltymų ekspresija yra didžiausia.
Atlikus eksperimentus paaiškės, kad IPTG koncentracija nėra tokia didelė, kokia įmanoma. Taip yra todėl, kad IPTG yra tam tikru požiūriu toksiškas bakterijoms. Viršijus koncentraciją, ląstelė taip pat žūsta; ir apskritai tikimės, kad kuo daugiau tirpių baltymų bus ekspresuojama ląstelėje, tuo geriau, tačiau daugeliu atvejų, kai IPTG koncentracija yra per didelė, susidarys didelis intarpų kiekis. Tačiau tirpių baltymų kiekis sumažės. Todėl tinkamiausia IPTG koncentracija dažnai yra ne didesnė, tuo geriau, o mažesnė koncentracija.
Genetiškai modifikuotų padermių indukcijos ir kultivavimo tikslas – padidinti tikslinio baltymo išeigą ir sumažinti sąnaudas. Tikslinio geno raiškai įtakos turi ne tik pačios padermės faktoriai ir raiškos plazmidė, bet ir kitos išorinės sąlygos, tokios kaip induktoriaus koncentracija, indukcijos temperatūra ir indukcijos laikas. Todėl apskritai, prieš ekspresuojant ir išgryninant nežinomą baltymą, geriausia ištirti indukcijos laiką, temperatūrą ir IPTG koncentraciją, kad būtų galima pasirinkti tinkamas sąlygas ir gauti geriausius eksperimentinius rezultatus.
Įrašo laikas: 2021 m. gruodžio 31 d.