Ditiotreitolis (DTT) yra dažnai naudojamas reduktorius, dar žinomas kaip naujasis žaliasis priedas. Tai mažamolekulinis organinis junginys su dviem merkaptanų grupėmis (-SH). Dėl savo redukcinių savybių ir stabilumo DTT plačiai naudojamas biochemijos ir molekulinės biologijos eksperimentuose.
Pagrindinis DTT vaidmuo yra sumažinti disulfidinius ryšius baltymuose ir kitose biomolekulėse. Disulfidinis ryšys yra svarbi baltymo lankstymosi ir stabilumo dalis, tačiau tam tikromis eksperimentinėmis sąlygomis, tokiomis kaip redukuojama SDS-PAGE analizė, baltymų rekombinacija ir lankstymasis, būtina redukuoti disulfidinį ryšį iki dviejų tiolio grupių, kad būtų išaiškinta baltymo erdvinė struktūra. DTT gali reaguoti su disulfidiniais ryšiais ir redukuoti juos iki merkaptano grupių, taip atverdamas baltymo erdvinę struktūrą ir palengvindamas jo analizę bei manipuliavimą.
DTT taip pat gali būti naudojamas fermento aktyvumui ir stabilumui apsaugoti. Kai kuriose fermentų katalizuojamose reakcijose oksidatorius gali sumažinti fermento aktyvumą. DTT gali reaguoti su oksidatoriais ir juos redukuoti iki nekenksmingų medžiagų, taip apsaugodamas fermento aktyvumą ir stabilumą.
Lyginant su tradiciniais reduktoriais, tokiais kaip β-merkaptoetanolis (β-ME), DTT laikomas saugesniu ir stabilesniu reduktoriumi. Jis ne tik stabilus vandeniniame tirpale, bet ir išlaiko savo redukcines savybes aukštoje temperatūroje ir rūgštinėje-šarminėje terpėje.
DTT naudojimas yra gana paprastas. Paprastai DTT ištirpinamas tinkamame buferyje ir įpilamas į eksperimentinę sistemą. Optimali DTT koncentracija turi būti nustatyta atsižvelgiant į konkretų eksperimentą ir paprastai naudojama 0,1–1 mM diapazone. Mažesnės koncentracijos gali sumažinti neigiamą poveikį ląstelių augimui ir citotoksiškumą dėl tikslinių baltymų perteklinės raiškos. Didesnės koncentracijos gali sukelti per didelę ląstelių metabolinę naštą, paveikti ląstelių augimą ir raiškos efektyvumą.
Optimalios koncentracijos nustatymo būdas gali būti tikslinio baltymo raiškos lygio įvertinimas, atliekant IPTG indukcijos testus esant skirtingoms koncentracijoms. Mažos apimties kultūros testai gali būti atliekami naudojant įvairias IPTG koncentracijas (pvz., 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM ir kt.), o raiškos efektas esant skirtingoms koncentracijoms gali būti įvertintas nustatant tikslinio baltymo raiškos lygį (pvz., Western blot arba fluorescencijos detekcija). Remiantis eksperimentiniais rezultatais, optimalia koncentracija buvo pasirinkta ta, kuri pasižymi geriausiu raiškos efektu.
Be to, galite remtis atitinkama literatūra arba kitų laboratorijų patirtimi, kad suprastumėte dažniausiai naudojamą IPTG koncentracijos diapazoną panašiomis eksperimentinėmis sąlygomis, o tada optimizuotumėte ir pakoreguotumėte pagal eksperimentinius poreikius.
Svarbu atkreipti dėmesį, kad optimali koncentracija gali skirtis priklausomai nuo skirtingų raiškos sistemų, tikslinių baltymų ir eksperimentinių sąlygų, todėl geriausia ją optimizuoti kiekvienu atveju atskirai.
Apibendrinant, DTT yra dažnai naudojamas reduktorius, kuris gali būti naudojamas disulfidinėms jungtims baltymuose ir kitose biomolekulėse redukuoti ir fermentų aktyvumui bei stabilumui apsaugoti. Jis plačiai naudojamas biochemijos ir molekulinės biologijos eksperimentuose.
Įrašo laikas: 2023 m. rugsėjo 28 d.