Ditiotreitolis (DTT) yra dažniausiai naudojamas reduktorius, dar žinomas kaip naujasis žalias priedas.Tai mažos molekulinės masės organinis junginys, turintis dvi merkaptano grupes (-SH).Dėl savo redukuojančių savybių ir stabilumo DTT plačiai naudojamas biochemijos ir molekulinės biologijos eksperimentuose.
Pagrindinis DTT vaidmuo yra sumažinti disulfidinius ryšius baltymuose ir kitose biomolekulėse.Disulfidinė jungtis yra svarbi baltymų lankstymo ir stabilumo dalis, tačiau esant tam tikroms eksperimentinėms sąlygoms, tokioms kaip redukuojama SDS-PAGE analizė, baltymų rekombinacija ir lankstymas, būtina disulfidinį ryšį redukuoti į dvi tiolio grupes, kad būtų atskleista erdvinė struktūra. baltymas.DTT gali reaguoti su disulfidiniais ryšiais, kad jas redukuotų į merkaptano grupes, taip atverdama erdvinę baltymo struktūrą ir palengvindama analizę bei manipuliavimą.
DTT taip pat gali būti naudojamas fermentų aktyvumui ir stabilumui apsaugoti.Kai kurių fermentų katalizuojamų reakcijų metu oksidantas gali sumažinti fermento aktyvumą.DTT gali reaguoti su oksidatoriais, kad jie taptų nekenksmingomis medžiagomis ir taip apsaugotų fermento aktyvumą ir stabilumą.
Palyginti su tradiciniais reduktoriais, tokiais kaip β-merkaptoetanolis (β-ME), DTT laikomas saugesniu ir stabilesniu reduktoriumi.Jis ne tik stabilus vandeniniame tirpale, bet ir išlaiko redukcines savybes aukštoje temperatūroje ir rūgščių-šarmų sąlygomis.
DTT naudojimas yra gana paprastas.Paprastai DTT ištirpinamas atitinkamame buferyje ir pridedamas prie eksperimentinės sistemos.Optimali DTT koncentracija turi būti nustatyta pagal konkretų eksperimentą ir paprastai naudojama 0,1–1 mM diapazone.Mažesnės koncentracijos gali sumažinti neigiamą poveikį ląstelių augimui ir gali sumažinti citotoksiškumą dėl per didelės tikslinių baltymų ekspresijos.Didesnės koncentracijos gali sukelti per didelę ląstelių metabolinę naštą, paveikti ląstelių augimą ir ekspresijos efektyvumą.
Optimalios koncentracijos nustatymo būdas gali būti tikslinio baltymo ekspresijos lygio įvertinimas, atliekant skirtingų koncentracijų IPTG indukcijos testus.Mažos apimties kultūros bandymai gali būti atliekami naudojant įvairias IPTG koncentracijų diapazonas (pvz., 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM ir tt), o ekspresijos efektas esant skirtingoms koncentracijoms gali būti įvertintas nustatant tikslinio baltymo (pvz., Western) ekspresijos lygį. dėmė arba fluorescencinis aptikimas).Remiantis eksperimento rezultatais, kaip optimali koncentracija buvo parinkta geriausią ekspresijos efektą turinti koncentracija.
Be to, galite remtis atitinkama literatūra arba kitų laboratorijų patirtimi, kad suprastumėte dažniausiai naudojamą IPTG koncentracijos diapazoną panašiomis eksperimentinėmis sąlygomis, o tada optimizuoti ir koreguoti pagal eksperimentinius poreikius.
Svarbu pažymėti, kad optimali koncentracija gali skirtis priklausomai nuo skirtingų ekspresijos sistemų, tikslinių baltymų ir eksperimentinių sąlygų, todėl geriausia optimizuoti kiekvienu konkrečiu atveju.
Apibendrinant galima pasakyti, kad DTT yra dažniausiai naudojamas reduktorius, kuris gali būti naudojamas baltymų ir kitų biomolekulių disulfidiniams ryšiams sumažinti ir fermentų aktyvumui bei stabilumui apsaugoti.Jis buvo plačiai naudojamas biochemijos ir molekulinės biologijos eksperimentuose.
Paskelbimo laikas: 2023-09-28